Sản xuất và đặc tính sinh hóa của laccase nấm sò NRC 620 và đánh giá hiệu quả của nó trong việc làm trong nước ép táo.

Sau 25 ngày ủ tĩnh ở 28°C, laccase từ *Pleurotus ostreatus* NRC620 cho thấy hoạt tính cao nhất trong môi trường nuôi cấy nấm. Giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho enzyme này lần lượt là 3,0 và 70°C. Sau 2 giờ ủ ở 40°C và 50°C, hoạt tính enzyme được giữ lại lần lượt là 68,33% và 59,61%. Sau 2 giờ ủ trong dung dịch đệm citrate-phosphate (pH 7,0), hoạt tính enzyme vẫn giữ ở mức 100%. Việc bổ sung 10 mM MgSO₄ và CuSO₄ làm tăng hoạt tính enzyme lên khoảng 21% và 35% tương ứng, trong khi NaCl, MnCl₂, KCl và CaCl₂ ức chế hoạt tính enzyme. Sử dụng ABTS làm chất nền, các thông số động học (Km và Vmax) của laccase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lần lượt là 1,99 mM và 16.217 μmol min−1 L−1. Xử lý enzyme đối với các mẫu nước ép táo đã làm giảm đáng kể cả độ pH và độ nhớt, và sự giảm này tương quan với sự gia tăng thời gian bảo quản. Xử lý bằng laccase dẫn đến sự giảm nhẹ hàm lượng phenolic tổng trong nước ép táo, nhưng không quan sát thấy sự giảm hoạt tính chống oxy hóa.
Những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã tập trung vào việc ứng dụng công nghệ sinh học xanh trong ngành công nghiệp thực phẩm. Laccase là một trong những enzyme hữu ích nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm, được ứng dụng trong các lĩnh vực như chế biến nước ép, làm bánh, ổn định rượu vang và cải thiện chất lượng cảm quan của sản phẩm thực phẩm.¹Nhiều loài thực vật bậc cao và vi sinh vật tiết ra enzyme laccase.²và các loại nấm như deuteromycetes, ascomycetes và basidiomycetes cũng có thể sản xuất laccase.³Laccase (EC 1.10.3.2) là một loại oxidase màu xanh lam, có khả năng khử oxy phân tử thành nước bằng một hệ thống gồm ba nguyên tử đồng khác nhau, từ đó oxy hóa nhiều hợp chất phenolic và amin thơm. Trong quá trình sản xuất nước ép trái cây và rau quả, hiện tượng hóa nâu do enzyme và không do enzyme là những vấn đề quan trọng.⁴Vì những chất này ảnh hưởng tiêu cực đến màu sắc, hương vị và mùi thơm của nước ép, nên chúng phải được loại bỏ.⁵
Trong tất cả các loại trái cây, táo là loại được tiêu thụ nhiều nhất trên toàn thế giới và tại Liên minh châu Âu. Năm 2019, sản lượng táo đứng thứ ba toàn cầu, vượt quá 87 triệu tấn.⁶Táo chứa nhiều hợp chất phenolic, bao gồm flavonoid và các axit phenolic như axit caffeic và axit chlorogenic.⁷Vì nước ép táo thường được tiêu thụ ở dạng trong suốt, nên khoảng 50% đến 90% các thành phần phenolic bị mất đi trong quá trình lọc.⁸Ngày nay, người tiêu dùng có xu hướng lựa chọn các sản phẩm chế biến tối thiểu, chẳng hạn như nước ép táo đục có hàm lượng polyphenol cao. Tuy nhiên, do hàm lượng phenolic cao, loại nước ép táo này đặc biệt dễ bị đổi màu và sẫm màu.⁹Nhiều công nghệ khác nhau, bao gồm các phương pháp xử lý nhiệt như tiệt trùng ở 60–90°C, được sử dụng để giảm hoặc ngăn ngừa hiện tượng sẫm màu của nước ép táo.¹⁰Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Sauceda-Gálvez¹¹Quá trình xử lý nhiệt có thể phá hủy các hợp chất dễ bay hơi và ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của nước ép táo. Các phương pháp thay thế cho xử lý nhiệt bao gồm carbon dioxide siêu tới hạn, bức xạ tia cực tím, siêu âm, áp suất thủy tĩnh cao hoặc đồng hóa áp suất cao.¹²Hiệu quả của các công nghệ này và sản lượng nước ép trái cây đạt yêu cầu phụ thuộc vào các thông số được sử dụng và đặc điểm của sản phẩm. Việc sử dụng rộng rãi chúng bị hạn chế bởi chi phí cao, tác động bất lợi đến chất lượng của một số sản phẩm thực phẩm hoặc khả năng vô hiệu hóa enzyme không đầy đủ.^13,14
Laccase có thể được sử dụng để ổn định và làm trong nước ép trái cây.¹⁵Gökmen và cộng sự¹⁶Khuyến nghị sử dụng laccase để làm trong nước ép trái cây vì nó loại bỏ hiệu quả các hợp chất phenolic bằng cách chuyển hóa chúng thành các polyme hoặc oligome dễ dàng bị loại bỏ bởi bất kỳ màng siêu lọc nào, giúp nước ép táo duy trì màu sắc và độ trong ổn định đến sáu tuần ở 50°C. Laccase *Trichoderma* tinh khiết được cố định trên các hạt alumina và được sử dụng để loại bỏ chọn lọc các hợp chất gây mùi vị khó chịu do nhiễm khuẩn trong nước ép táo.¹⁷
Khoảng 80-90% các thành phần dễ bay hơi trong nước ép táo là este và aldehyd, tạo nên hương thơm đặc trưng cho nước ép.¹⁸Enzyme laccase từ *Trametes versicolor* được cố định trên một chất nền rẻ tiền làm từ sợi tự nhiên từ vỏ dừa non để làm trong nước ép táo.¹⁹Các nghiên cứu trước đây đã điều tra việc ổn định nước ép táo (màu sắc và độ đục) bằng các phương pháp không sử dụng enzyme hoặc cố định enzyme, hoặc kết hợp với siêu lọc.^5,19Tuy nhiên, tác dụng của enzyme laccase từ nấm đối với các tính chất lý hóa của nước ép táo trong quá trình bảo quản vẫn chưa rõ ràng. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là điều tra thực nghiệm sự thay đổi về các tính chất lý hóa, hàm lượng hợp chất phenolic và hoạt tính chống oxy hóa của nước ép táo sau khi xử lý bằng enzyme laccase từ nấm và bảo quản lạnh trong hai tuần. Enzyme laccase có khả năng oxy hóa các hợp chất phenolic, điều này làm cho chúng trở nên đầy hứa hẹn để sử dụng trong nhiều quy trình công nghiệp khác nhau, bao gồm cả quá trình làm trong nước ép. Nghiên cứu này đã kiểm tra enzyme laccase từ nấm sò *Pleurotus ostreatus* NRC 620, tập trung vào các điều kiện lý tưởng cho hoạt động và hiệu quả của chúng trong quá trình làm trong nước ép. Mặc dù nghiên cứu về nấm sò (P. ostreatus NRC 620) vẫn còn hạn chế, các nghiên cứu trước đây đã kiểm tra các enzyme từ nhiều nguồn nấm khác nhau, chẳng hạn như Trametes versicolor và Ganoderma lucidum. Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá tiềm năng ứng dụng của enzyme này trong ngành công nghiệp thực phẩm và làm nổi bật các đặc tính độc đáo của nó, đặc biệt là độ pH và nhiệt độ lý tưởng.
2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) được mua từ Sigma-Aldrich (Canada). Tất cả các thuốc thử khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích.
Trung tâm Thu thập Mẫu Nuôi cấy Vi sinh vật thuộc Trung tâm Nghiên cứu Quốc gia đã thu được chủng nấm sò NRC620 đã biết. Sau khi cấy chuyển, chủng này được bảo quản trên môi trường thạch khoai tây dextrose ở 4°C. Phương pháp chuẩn bị giống như sau: Sợi nấm phát triển hoàn toàn, 10 ngày tuổi được cấy lên đĩa thạch khoai tây dextrose và ủ ở 28°C. Sau 10 ngày, ba khối sợi nấm đường kính 12 mm được lấy ra khỏi môi trường thạch bằng dụng cụ đục kim loại vô trùng và đặt vào bình Erlenmeyer 250 mL có nút bông chứa 50 mL môi trường nuôi cấy vô trùng (pH 5.0, như đã mô tả trước đây bởi Othman et al.).²⁰Các mẫu nuôi cấy được ủ ở 28°C trong 18 ngày. Sau đó, dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc Whatman số 1, và phần dịch lọc thu được được dùng làm nguồn enzyme.
Hoạt tính laccase được xác định bằng cách sử dụng ABTS làm chất nền. Hỗn hợp phản ứng (2 mL) chứa 500 μL ABTS 0,3 mM (hòa tan trong dung dịch đệm natri citrat 0,1 M, pH 4,5) và lượng mẫu enzyme cần thiết được pha loãng với nước cất.^21,22Vì laccase có thể oxy hóa ABTS ở nhiệt độ phòng (28 °C ± 2), quá trình oxy hóa ABTS được xác định bằng cách đo sự tăng độ hấp thụ ở bước sóng 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1(Sử dụng máy quang phổ UV Agilent Carry-100). Cần một đơn vị hoạt tính laccase để oxy hóa 1 μmol ABTS mỗi phút. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford sử dụng albumin huyết thanh bò làm chất đối chứng nội bộ.^23,24
Sau khi thu được enzyme từ chủng nấm sò NRC 620, hoạt tính của enzyme được đo ở các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau trong 25 ngày trong điều kiện tĩnh ở 28 °C.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của laccase, các thí nghiệm được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 20 đến 90 °C. Trước khi thêm enzyme và bắt đầu phản ứng, dung dịch đệm (natri citrat 0,1 M, pH 4,5) và chất nền (ABTS) được trộn lẫn và ủ trong 5 phút ở các nhiệt độ khác nhau. Độ ổn định nhiệt của enzyme được đánh giá bằng cách ủ trong dung dịch đệm natri photphat 0,05 M (pH 7,0) ở 40, 50, 60 và 70 °C trong 2 giờ. Hoạt tính còn lại sau đó được đánh giá bằng cách sử dụng chất nền ABTS.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính laccase được đánh giá bằng cách sử dụng ABTS làm chất nền trong dung dịch đệm citrate-phosphate 0,1 M với phạm vi pH từ 2,5 đến 7,0. Dung dịch enzyme được ủ ở 40°C trong hai giờ trong dung dịch đệm citrate và Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 và 7) để đánh giá độ ổn định pH. Hoạt tính còn lại với ABTS làm chất nền được tính toán sau khi ủ.
Enzyme laccase được ủ trong 10 phút trong dung dịch đệm natri photphat (0,05 M, pH 7,0) chứa các ion kim loại khác nhau (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, và Mn2+) ở nồng độ lần lượt là 2,5 mM và 10 mM. Sau đó, chất nền (ABTS) được thêm vào để bắt đầu phản ứng, và hoạt tính tương đối được đánh giá.
Quá trình oxy hóa ABTS bởi laccase ở các nồng độ khác nhau (0,025–3 mM) được đo ở pH 4,5 để xác định các thông số động học (Vmax và Km). Động học^{hằng số}Các hằng số động học của phương trình Michaelis-Menten được tính toán bằng cách sử dụng đồ thị Lineweaver-Burk, đồ thị này biểu diễn nghịch đảo của tốc độ phản ứng theo hàm số nồng độ chất nền. Các hằng số động học được tính toán từ đồ thị Lineweaver-Burk bằng phần mềm GraphPad Prism phiên bản 6.01.
Sau khi rửa sạch táo bằng nước máy, chúng được cắt đôi và ép lấy nước bằng máy ép táo tự động Braun MP80 (sản xuất tại Đức). Nước ép được lọc qua bốn lớp vải lọc. Nhóm đối chứng không được thêm enzyme, trong khi nhóm còn lại được thêm 2,0% laccase (nồng độ hiệu quả nhất đã được thử nghiệm) vào nước ép táo mới ép, sau đó được bảo quản ở 4°C trong hai tuần.
Độ axit chuẩn độ (TA) và pH được xác định theo phương pháp của Boulton et al.^al.27Độ pH của mỗi mẫu được đo bằng máy đo pH kỹ thuật số (máy đo pH JENWAY 3510). Độ axit chuẩn độ (TA) được tính toán dựa trên axit malic bằng công thức sau.
Trong đó, V và C lần lượt là thể tích (mL) và nồng độ (0,1 mol/L) của dung dịch natri hydroxit được sử dụng trong phép chuẩn độ. K là hệ số chuyển hóa axit malic, bằng 0,067, và W là khối lượng (g) nước ép táo.
Tổng chất rắn hòa tan (^TDSHàm lượng đường trong tất cả các mẫu nước ép được xác định bằng máy đo khúc xạ cầm tay PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Nhật Bản). Sau mỗi lần đo, thấu kính quang học được rửa sạch bằng nước khử ion, và mỗi mẫu nước ép táo được kiểm tra ba lần. Giá trị của mỗi mẫu được tính bằng cách lấy trung bình của ba lần đo. Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của mỗi mẫu nước ép táo cũng được tính bằng cách lấy trung bình các kết quả này.
Độ nhớt đàn hồi của các mẫu nước ép táo được đánh giá bằng máy đo độ nhớt quay (RV, Rheotest 2, Đức). Mẫu được đặt bên trong xi lanh “S2” của máy đo độ nhớt. Độ nhớt biểu kiến ​​được biểu thị bằng độ dốc của đường cong ứng suất cắt so với tốc độ cắt, được tính toán từ ứng suất cắt và các đường cong tương ứng ở các tốc độ cắt khác nhau (từ 1,00 đến 437,4 s⁻¹). Công thức tính độ nhớt biểu kiến ​​như sau:
Trong đó η là độ nhớt biểu kiến ​​(cP), τ là ứng suất cắt (dyn/cm²), γ là tốc độ cắt (sec⁻¹), và (τ) được tính bằng cách sử dụng các giá trị mô-men xoắn (α) và hình trụ (Z) theo công thức sau: τ = Z . α.
Chỉ số hóa nâu được xác định theo phương pháp của Meidav ​​​​et^al.29Mẫu nước ép 10 ml được ly tâm ở tốc độ 2750 xg trong 10 phút. 5 ml dịch nổi của nước ép được trộn với 5 ml etanol 95%. Độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 420 nm bằng máy quang phổ UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Tổng hàm lượng phenolic (TPC) được xác định bằng phương pháp đo màu sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu như mô tả bởi Boulton et al.^[27Đường cong chuẩn của axit gallic được xây dựng cho nồng độ từ 0 đến 500 mg/L (^r²= 0,997). Kết quả được biểu thị dưới dạng đương lượng axit gallic (mg GAE/mL).
Thêm 125 μL nước cất và 2850 μL dung dịch FRAP vào 25 μL nước ép táo và để hỗn hợp trong bóng tối trong một thời gian.³⁰phút. Sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 593 nm bằng máy quang phổ UV Shimadzu (UV-1601 PC). Thuốc thử FRAP được pha chế bằng cách trộn dung dịch đệm axetat 300 mM (pH 3,6), sắt(III) clorua 20 mM và 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazine (TPTZ) 10 mM (hòa tan trong HCl 40 mM) theo tỷ lệ 10:1:1. Đường cong chuẩn được tạo ra bằng cách sử dụng Trolox làm chất chuẩn (^R²= 0,999), và kết quả được biểu thị bằng μM Trolox/mL.
Hoạt tính chống oxy hóa của nước ép đã qua xử lý và chưa qua xử lý được xác định bằng phương pháp DPPH để đánh giá khả năng loại bỏ các gốc tự do DPPH của chúng.³¹Mười microlít nước ép được trộn với 1 ml dung dịch DPPH (100 μM) trong methanol. Sau khi phản ứng trong bóng tối 30 phút, độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 517 nm bằng máy quang phổ UV Shimadzu (UV-1601 PC). Kết quả được biểu thị dưới dạng đương lượng trolox (μM trolox/ml) dựa trên đường cong hiệu chuẩn (_^R2= 0,990).
Dữ liệu thu được cho thấy sản lượng laccase tối đa được quan sát thấy ở nấm sò NRC 620 vào cuối ngày thứ 18 của quá trình lên men, đạt hoạt tính 1302 U/L. Điều này làm cơ sở để xác định thời gian nuôi cấy tối ưu cho sản xuất laccase (Hình 1). Mặc dù sản lượng enzyme tăng lên khi thời gian nuôi cấy tăng, nhưng tốc độ tăng không tỷ lệ thuận trực tiếp với thời gian nuôi cấy; sau 21 ngày, hoạt tính enzyme chỉ tăng thêm 90 U/L (lên 1390 U/L). Do đó, 18 ngày cuối cùng được chọn là thời gian nuôi cấy tối ưu để cân bằng năng suất sản phẩm với lợi ích kinh tế của việc tăng thời gian nuôi cấy.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến năng suất laccase ở nấm Pleurotus ostreatus NRC 620. Ba khối sợi nấm (12 mm) được cấy vào 50 ml môi trường vô trùng và sau đó được nuôi cấy ở 28 °C trong các khoảng thời gian khác nhau.
Phù hợp với các nghiên cứu khác, kết quả của chúng tôi cho thấy thời gian nuôi cấy lý tưởng để đạt được mức tiết laccase cao nhất ở nấm có thể nằm trong khoảng từ 7 đến 36 ngày.³²Theo Ezike và cộng sự.³³*Trametes polyzona* WRF03 sản sinh ra lượng laccase cao nhất vào cuối ngày thứ chín của quá trình lên men, với hoạt tính đặc hiệu là 1637 U/mg protein. Hơn nữa, Othman et al.³⁴Người ta phát hiện ra rằng *Trichoderma harzianum* S7113 tiết ra một lượng lớn laccase vào ngày thứ năm nuôi cấy. Tốc độ sản xuất laccase đạt đỉnh điểm vào ngày thứ mười bốn và sau đó giảm dần.³⁴Mặc dù quá trình tiết enzyme cũng có thể xảy ra trong giai đoạn tăng trưởng chính, nhưng nó thường đạt đỉnh điểm trong giai đoạn trung gian và được kích hoạt bởi sự tiêu thụ nguồn carbon hoặc nitơ.^34,35
Mặc dù laccase từ Pleurotus ostreatus NRC 620 thể hiện hoạt tính cao trong phạm vi nhiệt độ rộng từ 50°C đến 80°C, gần đạt hoạt tính cực đại (69–98%), hoạt tính tối đa được quan sát thấy ở 70°C (Hình 2a). Bên ngoài phạm vi nhiệt độ này, hoạt tính của enzyme giảm ở khoảng 70°C. Những kết quả này cho thấy enzyme hoạt động ở nhiệt độ cao, có thể là do nhiệt độ cao làm tăng động năng của phản ứng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng (a) và pH (b) đến hoạt tính laccase trong *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Nhiệt độ từ 20 đến 90 °C được đạt được bằng cách ủ hỗn hợp ở các nhiệt độ khác nhau trong 5 phút trước khi thêm enzyme và bắt đầu phản ứng. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính laccase được đánh giá bằng cách sử dụng ABTS làm chất nền trong dung dịch chứa đệm citrate-phosphate 0,1 M ở phạm vi pH từ 2,5 đến 7,0.
Theo Ezike et^al.33Nhiệt độ tối ưu cho enzyme laccase của *Trametes polyzona* WRF03 là 55 °C, giống với nhiệt độ tối ưu cho *Ganoderma lucidum*.^laccase36và tương tự như nhiệt độ tối ưu (50 °C) đối với *Trametes polyzona* KU-RNW02737^laccase . ^Baldrian38Lưu ý rằng, cũng như các hệ thống enzyme phân giải lignin khác, phạm vi nhiệt độ lý tưởng cho laccase là từ 50 đến 70 °C.
Kết quả cho thấy enzyme thể hiện hoạt tính cao nhất ở pH 3,0, đạt 94% hoạt tính ở pH 3,5. Tuy nhiên, nó vẫn hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 2,5 đến 7,0 (Hình 2b). Hơn nữa, nó thể hiện hoạt tính cao hơn trong điều kiện axit so với điều kiện trung tính hoặc kiềm. Hoạt tính của nó duy trì ở mức ít nhất 77% trong phạm vi pH từ 2,5 đến 4,5, nhưng chỉ đạt khoảng 38% ở pH 7,0. Độ pH tối ưu cho laccase từ *Trametes polyzona* WRF03 là 4,533, giống với độ pH của laccase từ *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 và *Trametes hirsuta* 41. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Chairin et al.⁴²Độ pH tối ưu cho laccase từ *Polymorpha f. sp.* WR710-1 là 2,2, trong khi độ pH tối ưu cho laccase từ *Polymorpha f. sp.* IBL-04 là 5,043. Sự liên kết của các anion hydroxit (chất ức chế laccase) với các nguyên tử đồng của laccase T2/T3 có thể là nguyên nhân dẫn đến giảm hoạt tính của laccase trong điều kiện pH trung tính hoặc kiềm. Điều này có thể làm gián đoạn quá trình truyền electron nội bộ từ trung tâm T1 đến trung tâm T2/T3, do đó^{giới hạn}hoạt động của enzyme23,44
Bằng cách ủ enzyme ở các nhiệt độ khác nhau, người ta nhận thấy cả thời gian và nhiệt độ ủ đều ảnh hưởng đến độ ổn định của enzyme. Đáng chú ý, laccase từ *Trametes polyzona* NRC 620 thể hiện độ ổn định cao hơn ở 40℃ và 50℃, giữ lại lần lượt 68,33% và 59,61% hoạt tính ban đầu sau 120 phút (Hình 3a). Ngược lại, trong cùng điều kiện (40℃ và 50℃, 120 phút), laccase từ *Trametes polyzona* WRF03 giữ lại lần lượt 64,38% và 42,92% hoạt tính.³³Ngược lại, việc tăng thời gian và nhiệt độ ủ làm giảm độ ổn định của laccase từ *Trametes polyzona* NRC 620; Sau khi ủ ở 60℃ và 70℃ trong 60 phút, hoạt tính của nó giảm xuống còn 39,24% và 1,72% tương ứng (Hình 3a). Phù hợp với kết quả thực nghiệm, laccase từ *Trametes polyzona* WRF03 cho thấy độ ổn định cao hơn ở 40 và 50℃ trong suốt quá trình xử lý nhiệt.³³Tương tự, Lueangjaroenkit et^al.37và Chairin et^al.42Nghiên cứu đã báo cáo về độ ổn định của laccase từ Trametes polyzona KURNW027 và Trametes polyzona WR710-1 ở 50 °C trong 1 giờ. Là một chất xúc tác sinh học hữu ích có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học, laccase cần có độ ổn định và hiệu suất tốt trong phạm vi nhiệt độ rộng.
Độ ổn định nhiệt (a) và độ ổn định pH (b) của laccase từ *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Độ ổn định nhiệt được đánh giá bằng cách ủ dung dịch enzyme trong dung dịch đệm natri photphat 0,05 M (pH 7,0) ở 40, 50, 60 và 70 °C trong 2 giờ. Độ ổn định pH được đánh giá bằng cách ủ dung dịch enzyme trong dung dịch đệm citrat 0,1 M và dung dịch đệm Tris (pH 3, 4, 6 và 7) ở 40 °C trong 2 giờ. Hoạt tính còn lại được tính toán bằng cách sử dụng ABTS làm chất nền sau khi ủ.
Để xác định điều kiện tối ưu cho việc sử dụng và bảo quản enzyme, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến độ ổn định của laccase. Tiếp xúc với các giá trị pH khác nhau ảnh hưởng đáng kể đến độ ổn định của cấu trúc protein, từ đó ảnh hưởng đến độ ổn định và hoạt tính của phân tử enzyme. Kết quả cho thấy enzyme kém ổn định hơn trong điều kiện axit, trong khi thể hiện độ ổn định tốt hơn ở các giá trị pH cao hơn (vùng trung tính và kiềm). Ở các giá trị pH 7,0, 6,0, 4,0 và 3,0, tỷ lệ giữ lại enzyme sau 120 phút lần lượt là khoảng 100%, 62,54%, 52,39% và 11,14% (Hình 3b). Laccase *Strombus multisus* WRF03 cho thấy độ ổn định cao hơn ở các giá trị pH trung tính (5,5–6,5) và độ ổn định thấp hơn ở các giá trị pH axit (dưới 4,0). Sau 120 phút ở các giá trị pH ​​5,5, 6,0 và 6,5, tỷ lệ giữ lại enzyme lần lượt là khoảng 82%, 100% và 93%.³³Khairin và cộng sự⁴²lưu ý rằng laccase từ Trametes polyzona WR710-1 ổn định trong phạm vi pH từ 6,0 đến 7,0, trong khi Sayed et al.⁴⁵Kết quả cho thấy laccase ổn định hơn trong điều kiện pH trung tính. Tuy nhiên, laccase từ Cerrena unicolor cũng thể hiện tính ổn định trong điều kiện kiềm (pH 9.0).⁴⁶Các enzyme laccase được nghiên cứu cho thấy độ ổn định cao trong phạm vi pH rộng. Đây có thể là một đặc điểm quan trọng cho các ứng dụng công nghiệp.
Vì một số ion kim loại có cả tác dụng kích thích và ức chế hoạt động của enzyme, nên ảnh hưởng của chúng đến hoạt động của enzyme cần được xem xét trong các ứng dụng công nghiệp. Điều này rất quan trọng vì ion kim loại là những chất gây ô nhiễm môi trường phổ biến có thể ảnh hưởng đến sự ổn định và tổng hợp các enzyme ngoại bào.⁴⁷Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều ion kim loại lên enzyme laccase từ *Pleurotus ostreatus* NRC 620, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm tương ứng. Như thể hiện trong Hình 4, tùy thuộc vào loại kim loại được sử dụng, việc tăng nồng độ ion kim loại từ 2,5 mM lên 10 mM đã ảnh hưởng tiêu cực đến chức năng của enzyme. Ví dụ:^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, Và^Cu²⁺có thể kích thích và hoạt hóa hoạt động của enzyme, trong khi^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, Và^K⁺có thể ức chế hoạt động của enzyme. Ở nồng độ 10 mM, ion Cu²⁺ và Mg²⁺ là những chất kích hoạt mạnh nhất hoạt động của laccase từ *Pleurotus ostreatus* NRC 620, mang lại mức độ kích hoạt lần lượt khoảng 34% và 20%. Tuy nhiên, ở nồng độ 10 mM, ion Ca²⁺ là chất ức chế mạnh nhất laccase, làm giảm hoạt động của enzyme khoảng 60%.
Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của laccase từ nấm Pleurotus ostreatus NRC 620. Laccase được ủ trong 10 phút trong dung dịch đệm natri photphat (0,05 M, pH 7,0) chứa các ion kim loại khác nhau ở nồng độ 2,5 mM và 10 mM. Sau đó, phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm chất nền (ABTS), rồi đo hoạt tính tương đối.
Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả của các tác giả khác, những người đã phát hiện ra rằng Mg²⁺ và Cu²⁺ làm tăng hoạt tính của *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ đã phát hiện ra rằng laccase từ *Xylaria* sp. được kích thích ở một mức độ nhất định bởi các ion đồng (Cu²⁺). Hơn nữa, Foroutanfar et al.⁴⁹ và Si et al.⁵⁰ đã tiến hành các nghiên cứu tương tự trên laccase từ *Paraconiothyrium variabile* và *Trametes pubescens*, tương ứng. Vị trí liên kết đồng loại II (T2) của enzyme này có thể bão hòa với Cu²⁺ ở một nồng độ nhất định, điều này có thể giải thích sự kích thích hoạt tính của laccase ở nồng độ Cu²⁺³⁹ cao hơn. Vì laccase của nấm mục trắng là oxidase chứa nhiều nguyên tử đồng, nên tác động của ion đồng lên hoạt động của laccase rất đa dạng, từ kích thích, ức chế đến trung tính.⁵¹ Ngược lại, Zhou et al^{. [52]}đã đưa tin rằng^Cu²⁺Ức chế hoạt động laccase của mối đất Đài Loan (Odontotermes formosanus). Tuy nhiên, laccase của Cerena sp. HYB07^[53]và Clitocybe maxima^[54]không bị ảnh hưởng bởi các ion đồng.
Tính đặc hiệu của cơ chất được thể hiện bằng các thông số động học (Km và Vmax); cơ chất càng có ái lực liên kết mạnh với enzyme thì giá trị Km càng thấp và tính đặc hiệu của cơ chất càng cao.^3,21,55Các thông số động học (Km và Vmax) của laccase từ *Pleurotus ostreatus* NRC 620 được xác định bằng phần mềm GraphPad Prism 6.0 bằng cách vẽ đồ thị Lineweaver-Burk (Hình 5). Khi sử dụng ABTS làm chất nền, kết quả thu được là 1,99 mM và 16217 μmol.^{phút⁻¹ L⁻¹,}tương ứng. Elsayed và cộng sự.²¹Báo cáo cho biết giá trị Km cho quá trình oxy hóa ABTS lần lượt là 0,1 mM và 0,064 mM, cho thấy ái lực cao của các isoenzyme Lac A và Lac B đối với ABTS. Hơn nữa, giá trị Vmax là 0,182 μmol.^phút⁻¹và 0,603 μmol^phút⁻¹Tương ứng. Giá trị Km thu được thấp hơn so với Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); hơn nữa, giá trị Vmax của chúng (1429 mmol min⁻¹) cũng thấp hơn.^{thấp hơn}khi sử dụng ABTS làm chất nền.33 Tương tự, giá trị Km của nồng độ laccase Lentinus squarrosulus MR13 và Trametes sp. AH28-2 lần lượt là 0,0714 mM và 0,025 mM, và giá trị Vmax lần lượt là 0,0091 mM min−1 và 0,67 mM min−1 mg−1 (so với ABTS).^{tương ứng.56,57}
Ảnh hưởng của nồng độ ABTS đến hoạt tính của laccase từ *Pleurotus ostreatus* NRC 620 đã được nghiên cứu, và đồ thị Lineweaver-Burk biểu diễn nghịch đảo của vận tốc phản ứng ban đầu theo nồng độ ABTS đã được lập. Phản ứng oxy hóa ABTS với các nồng độ laccase khác nhau (0,025–3,0 mM) được đo ở pH 4,5 để xác định các thông số động học (Vmax và Km). Hằng số động học Michaelis-Menten được tính toán bằng cách sử dụng đồ thị Lineweaver-Burk biểu diễn nghịch đảo của vận tốc phản ứng theo nồng độ chất nền. Các hằng số động học được tính toán từ đồ thị Lineweaver-Burk bằng phần mềm GraphPad Prism 6.01.
Các enzyme làm trong truyền thống, chẳng hạn như pectinase, thủy phân các chất pectin, làm giảm độ nhớt và độ đục. Chúng phân giải hiệu quả các polysaccharid cấu trúc và thường được sử dụng kết hợp với các enzyme khác, chẳng hạn như cellulase và hemicellulase, để cải thiện năng suất và độ trong. Tuy nhiên, pectinase không nhắm mục tiêu cụ thể vào các hợp chất phenolic, vốn là tác nhân chính gây ra độ đục và hiện tượng nâu hóa do oxy hóa, đặc biệt là trong các loại nước ép như nước ép táo và nước ép nho.⁵⁸Ngược lại, laccase xúc tác quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic, polymer hóa chúng thành các phân tử lớn hơn, không tan, có thể được loại bỏ bằng phương pháp lắng đọng hoặc lọc. Cơ chế này không chỉ cải thiện độ trong suốt mà còn kéo dài thời hạn sử dụng của nước ép bằng cách giảm khả năng bị oxy hóa gây ra bởi các hợp chất phenolic. Hơn nữa, các quy trình làm trong nước ép bằng laccase có thể được thực hiện trong điều kiện xử lý nhẹ nhàng (pH 3,5–5,5, nhiệt độ 25–40 °C), thích hợp cho các loại nước ép tinh tế mà không làm ảnh hưởng đến các đặc tính dinh dưỡng hoặc cảm quan của chúng.⁵⁹Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng xử lý bằng pectinase có thể làm trong nước ép trong vòng 1-2 giờ, trong khi xử lý bằng laccase thường cần thời gian phản ứng lâu hơn (3-6 giờ) để khử hoàn toàn các hợp chất phenolic. Tuy nhiên, quá trình này có thể được tối ưu hóa bằng cách cố định enzyme hoặc kết hợp laccase với các phương pháp làm trong bằng cơ học.⁶⁰Trong nghiên cứu này, phân tích hoạt tính enzyme của dịch chiết thô cho thấy hoạt tính laccase và α-amylase đáng kể, trong khi hoạt tính pectinase và xylanase cực kỳ thấp, và không phát hiện hoạt tính cellulase. Do đó, sự giảm độ đục và hàm lượng phenolic chủ yếu là do tác động của laccase, trong khi sự thay đổi độ nhớt có thể một phần là do tác động của amylase.
Bảng 1 trình bày các thông số lý hóa của nước ép táo tươi và mẫu được xử lý bằng laccase. Kết quả cho thấy hiệu suất của nước ép táo tươi (71,59%) thấp hơn so với mẫu được xử lý bằng laccase (87,34%). Kết quả này phù hợp với phát hiện của Pilnik và Orange.⁶¹Người này chỉ ra rằng việc sử dụng enzyme trong chế biến trái cây có thể làm tăng sản lượng nước ép, cải thiện quá trình lọc và thu được nước ép chất lượng cao, trong suốt để cô đặc. Sự gia tăng sản lượng nước ép chủ yếu là do sự gia tăng hàm lượng đường hòa tan trong nước ép. Trong quá trình thủy phân enzyme của trái cây, chất keo và pectin trong thành tế bào của sản phẩm bị phá hủy và chuyển hóa thành các chất hòa tan như đường trung tính và axit.^62.Giá trị pH của nước ép táo được xử lý bằng enzyme thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P < 0,05), và giá trị pH của cả hai nhóm đều tăng đáng kể trong quá trình bảo quản (Bảng 1). Kết quả này phù hợp với kết quả của Mark et al.⁶³Người này lưu ý rằng độ pH của nước ép quả điều giảm sau khi bảo quản sau khi xử lý nhiệt. Sự phân hủy pectin và sự hình thành axit galacturonic sau khi xử lý bằng enzyme có thể là nguyên nhân gây ra sự tăng pH trong quá trình bảo quản. Độ pH của các mẫu được xử lý bằng enzyme duy trì trong khoảng từ 4,05 đến 4,31 trong suốt quá trình bảo quản, trong khi độ pH của nước ép táo không được xử lý dao động từ 4,12 đến 4,33.
Tổng độ axit (TA) của cả mẫu chưa xử lý và mẫu được xử lý bằng laccase đều cho thấy xu hướng giảm dần theo thời gian bảo quản (Bảng 1). Sự giảm độ axit được cho là do sự chuyển hóa các axit hữu cơ thành carbohydrate hoặc các phản ứng enzym, cũng như quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản nước ép.⁶⁴Tổng độ axit của nước ép táo đối chứng và các mẫu được xử lý bằng enzyme thấp hơn so với các loại nước ép khác (nước ép dâu tây 0,9%, nước ép mận 2,2%, nước ép quất 1,0%, nước ép mơ 2,4%, nước ép cam 0,8%), nhưng tương tự như các loại nước ép khác (ví dụ: nước ép lê 0,3%).⁶²Những khác biệt về chất lượng nước ép táo tươi chưa qua xử lý có thể là do nhiều yếu tố khác nhau như điều kiện trồng trọt, yếu tố di truyền, độ chín và phương pháp chế biến.⁶⁵Sự giảm độ axit tổng thể của nước ép táo đối chứng và nước ép táo được xử lý bằng laccase phù hợp với kết quả do Singh et al. trình bày.⁶⁶liên quan đến sự giảm độ axit tổng thể của nước ép táo Jin Nuo sau 74 ngày bảo quản. Mặt khác, Oshmiansky và Wojdylo⁶⁷Không phát hiện thấy bất kỳ thay đổi đáng kể nào về độ axit của nước ép táo khi nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp làm trong truyền thống.
Kết quả trình bày trong Bảng 1 cho thấy giá trị tổng chất rắn hòa tan (TSS) của nước ép táo được xử lý bằng laccase cao hơn so với mẫu không được xử lý. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố.^{. 68}Hơn nữa, Bảng 1 cho thấy giá trị TSS của nhóm nước ép táo đối chứng là 9,58 tại thời điểm ban đầu và đạt 11,05 vào cuối thời kỳ bảo quản. Các giá trị này thấp hơn giá trị TSS của nước ép táo tươi được báo cáo bởi Hamid et al.^{. 69}(lần lượt là 11,2 và 11,80). Giá trị TSS của các mẫu nước ép táo được xử lý bằng laccase tăng lên đáng kể, bắt đầu từ 11,23 và đạt 12,93 sau hai tuần bảo quản ở 4°C (Bảng 1). Sự gia tăng tương tự về TSS trong quá trình bảo quản cũng được quan sát thấy ở các loại trái cây họ cam quýt, chanh và cam ngọt. Sự gia tăng tổng chất rắn hòa tan (TSS) trong quá trình bảo quản có thể là do sự thủy phân polysaccharid (tinh bột) thành monosaccharid (đường), sự gia tăng nồng độ do sự mất nước của nước ép và sự phân hủy pectin trong nước ép thành chất rắn hòa tan. Sự gia tăng tổng chất rắn hòa tan (TSS) có thể là do sự gia tăng lượng đường hòa tan, có thể được hình thành do sự chuyển đổi pectin hoặc cellulose thành đường hòa tan bởi pectin hoặc cellulase, tương ứng, hoặc do sự thủy phân tinh bột thành đường, như đã được báo cáo bởi Hamed et al.^69.Có thể quan sát trực quan tác dụng của laccase lên các đặc tính của nước ép táo, vì nước ép táo được xử lý bằng laccase thể hiện khả năng chảy tốt hơn và độ nhớt thấp hơn so với nước ép chưa được xử lý. Quan sát này được ghi lại trong Bảng 1; Độ nhớt của mẫu được xử lý bằng enzyme là 1,87 cP, trong khi độ nhớt của mẫu đối chứng là 2,95 cP. Sự giảm đáng kể về độ nhớt này có thể là do khả năng giữ nước cao hơn của các chất giống pectin và sự hình thành cấu trúc mạng lưới kết dính.
Trong nghiên cứu này, tác dụng của laccase lên chỉ số hóa nâu (BI) của nước ép táo được nghiên cứu bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 420 nm bằng máy quang phổ. Kết quả được thể hiện trong Bảng 1. Trong quá trình bảo quản, chỉ số BI của các mẫu nước ép táo ở cả nhóm được xử lý và nhóm không được xử lý đều cho thấy xu hướng tăng dần. BI phản ánh mức độ hóa nâu và có thể được sử dụng như một chỉ số đánh giá.^{một điều quan trọng}Chỉ thị cho các phản ứng hóa nâu do enzyme và không do enzyme. Độ hấp thụ tăng đáng kể trong quá trình bảo quản (P < 0,05). Vào cuối thời gian bảo quản,_A420Giá trị của các mẫu nước ép táo trong nhóm đối chứng và nhóm được xử lý bằng enzyme đã tăng lần lượt khoảng 217% và 121% (Bảng 1). Kết quả cho thấy xử lý bằng enzyme có thể làm giảm hiệu quả mức độ hóa nâu khoảng 56%. Kết quả của Bezerra et al.^[19] phù hợp với kết quả của chúng tôi; Họ đã sử dụng laccase-glutaraldehyde-chất xơ dừa để làm trong nước ép táo, giảm màu sắc ban đầu xuống 61%.
Mặc dù polyphenol trong nước ép trái cây có tác dụng dinh dưỡng và trị liệu tích cực đối với cơ thể con người, nhưng chúng cũng có thể phản ứng với protein, gây ra hiện tượng nước ép bị đục, lắng cặn hoặc vẩn đục, do đó làm thay đổi hương vị và mùi thơm của sản phẩm, đồng thời làm giảm thời hạn sử dụng.⁷¹Mục đích của nghiên cứu này là giảm hàm lượng hợp chất phenolic trong nước ép táo một cách an toàn bằng cách sử dụng laccase từ nấm Pleurotus ostreatus NRC 620. Kết quả trình bày trong Bảng 1 cho thấy tổng hàm lượng hợp chất phenolic trong nước ép táo được xử lý bằng laccase đã giảm đáng kể trước khi bảo quản ở 4 °C. Hơn nữa, tổng hàm lượng hợp chất phenolic cũng giảm trong quá trình bảo quản ở cả hai mẫu nghiên cứu (Bảng 1). Nghiên cứu của Sandri et al.⁷²Nghiên cứu cho thấy nước ép táo được xử lý bằng enzyme có thể giữ được hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng hợp chất phenolic. Tuy nhiên, kết quả của một nghiên cứu khác do Lettera et al. thực hiện...⁷³Nghiên cứu cho thấy việc xử lý nước cam bằng enzyme laccase từ nấm có thể làm giảm hàm lượng các hợp chất phenolic trong đó lên đến 45%.
Các hợp chất phenolic đã được chứng minh là có các đặc tính như loại bỏ gốc tự do, khử và dập tắt oxy đơn bội, chuyển giao nguyên tử hydro và cho electron cho các gốc tự do, khiến chúng trở thành chất chống oxy hóa mạnh mẽ.⁷⁴Do đó, trong nghiên cứu này, các phương pháp dựa trên DPPH và FRAP đã được sử dụng để đánh giá tác dụng của laccase đối với hoạt tính chống oxy hóa của nước ép táo được bảo quản trong tủ lạnh trong 14 ngày (Bảng 2). Cả hai phương pháp đều cho thấy sự gia tăng hoạt tính chống oxy hóa trong quá trình bảo quản, điều này có thể là do sự gia tăng các hợp chất phenolic tự do hoặc sự hình thành các sản phẩm phản ứng Maillard (MRP), trong đó các sản phẩm phản ứng Maillard có khả năng là nguyên nhân gây ra sự gia tăng hoạt tính chống oxy hóa.⁷⁵Các phản ứng hóa nâu không do enzyme (bao gồm sự phân hủy axit ascorbic, phản ứng Maillard và sự phân hủy đường xúc tác bởi axit) tạo ra các sắc tố nâu (melanoidin). Các sản phẩm trung gian của sự phân hủy axit ascorbic và các sản phẩm phân hủy đường (như các hợp chất cacbonyl) có thể phản ứng với các axit amin thông qua phản ứng Maillard.⁷⁶Mặc dù hiện tượng thâm đen của trái cây và rau quả trong quá trình bảo quản đã được nghiên cứu rộng rãi, nhưng sự hiểu biết của chúng ta về các phản ứng này vẫn còn hạn chế.⁷⁷So sánh với phương pháp FRAP, nước ép táo được xử lý bằng laccase cho thấy hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn đáng kể khi sử dụng phương pháp DPPH (Bảng 2), và hoạt tính chống oxy hóa của tất cả các mẫu đều tăng đáng kể theo thời gian bảo quản. Hai phương pháp khác nhau để xác định hoạt tính chống oxy hóa đã được sử dụng trong nghiên cứu này vì nguyên lý của chúng khác nhau. Phương pháp DPPH đo khả năng trung hòa các gốc tự do, trong khi phương pháp FRAP đo khả năng khử các ion sắt. Do đó, nên sử dụng nhiều phương pháp để xác định hoạt tính chống oxy hóa nhằm hiểu rõ hơn về hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu.⁷⁸
Một trong những phát hiện quan trọng của nghiên cứu này là enzyme laccase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 thể hiện hoạt tính tối ưu ở 70°C và pH 3.0. So với các enzyme laccase từ nấm khác thường được sử dụng để làm trong nước ép, chẳng hạn như laccase từ *Trametes versicolor* và *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 thể hiện độ ổn định nhiệt cao hơn và pH axit hơn. Laccase từ *Trametes versicolor* và *Ganoderma lucidum* thường thể hiện hoạt tính tối ưu trong khoảng 50-60°C và ở giá trị pH từ 3.5 đến 5.0. Sự khác biệt này có thể góp phần cải thiện hiệu quả làm trong nước ép, đặc biệt đối với nước ép có tính axit, nơi độ ổn định ở giá trị pH thấp là rất quan trọng. Đặc tính độc đáo của *P. ostreatus* NRC 620 so với các enzyme laccase từ nấm khác đã được nghiên cứu là khả năng hoạt động hiệu quả trong điều kiện khắc nghiệt hơn. Nhiệt độ hoạt động tối ưu cao hơn của nó cho thấy những lợi thế tiềm năng trong các ứng dụng công nghiệp, chẳng hạn như tốc độ phản ứng nhanh hơn và giảm ô nhiễm vi sinh vật. Độ pH thấp của nó, rất phù hợp với tính axit của nhiều loại nước ép, có thể hữu ích trong các quy trình làm trong nước ép. Những kết quả này chứng minh sự cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng trên quy mô lớn, biến *Pleurotus ostreatus* NRC 620 trở thành một lựa chọn thay thế khả thi cho các nguồn laccase nấm truyền thống. So với các nghiên cứu trước đây, chúng tôi nhận thấy rằng nhiệt độ tối ưu là 60°C và độ pH tối ưu là 3.0. Sau phản ứng ở 60°C trong 80 phút, laccase *Ganoderma lucidum* vẫn giữ được hoạt tính.⁴⁶% hoạt động của nó.79 Theo Kurniawati và Nicelle⁸⁰Các enzym từ *Ganoderma lucidum* thể hiện độ ổn định từ tốt đến trung bình ở 25°C và giá trị pH từ 5,0 đến 8,0, và ổn định ở pH 6,0 và nhiệt độ từ 10 đến 30°C. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzym của *Pleurotus ostreatus* lần lượt là 3,0 và 70°C. Sau khi ủ ở 40°C và 50°C trong hai giờ, enzym giữ lại lần lượt 68,33% và 59,61% hoạt tính. Hơn nữa, laccase từ Pleurotus ostreatus NRC 620 thể hiện hoạt tính cao trong phạm vi nhiệt độ rộng từ 50°C đến 80°C, gần đạt hoạt tính tối đa (69%–98%), với hoạt tính tối đa được quan sát thấy ở 70°C.
Tóm lại, enzyme laccase NRC620 từ nấm sò, thu được trong điều kiện tĩnh, thể hiện hoạt tính và độ ổn định tối ưu trong phạm vi pH và nhiệt độ khác nhau, cho thấy độ ổn định vượt trội so với các nguồn enzyme khác. Việc bổ sung 10 mM MgSO₄ và CuSO₄ làm tăng hoạt tính enzyme lên khoảng 21% và 35% tương ứng. Khi được chế biến thành nước ép táo, enzyme làm giảm độ pH và độ nhớt, trong khi hàm lượng phenolic chỉ giảm nhẹ trong quá trình bảo quản.
Kết quả nghiên cứu khẳng định tiềm năng của laccase trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong việc làm trong đồ uống. Bằng cách phân giải các hợp chất phenolic một cách chọn lọc, laccase không chỉ làm giảm độ đục và cải thiện độ trong mà còn duy trì chất lượng nước ép trái cây trong điều kiện vận hành nhẹ nhàng. Khác với các chất làm trong truyền thống như gelatin, bentonite và silica gel, laccase không tạo ra chất thải hoặc làm mất đi hương thơm dễ chịu của đồ uống, do đó là một lựa chọn thân thiện với môi trường và bền vững hơn. Hơn nữa, so với các enzyme và phương pháp lọc khác, laccase cung cấp một giải pháp hiệu quả về chi phí và nhắm mục tiêu cụ thể mà không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Kyomuhimbo, HD và Brink, HG. Các ứng dụng và chiến lược cố định laccase chứa đồng; một bài đánh giá. Heliyon 9, e13156 (2023).